注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Fmoc-N-Me-Val-OH烯基, 含穩(wěn)定劑銅, 97%氫氧化 AR,90%

Fmoc-Tyr(tBu)-OH2,2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽 98%氫氧化 granules,AR,90%

Fmoc-Thr(tBu)-OH4-氨基-3-羥基苯甲酸 98%氫氧化鈉 GR,97%,片狀

N-Hippuryl-His-Leu hydrate亞硫酸銨 94%氫氧化鈉 顆粒狀,AR,96%

O-Acetyl-L-serine hydrochloride氨基胍碳酸氫鹽 分析標(biāo)準(zhǔn)品活性炭 三層無(wú)紡布，一層活性碳

DSC順式-烏頭酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品，98%乙酰酮 GCS,≥99.6% (GC)

10% Iron chelateN-（4-氨酰）-L-谷氨酸 97%乙酰酮 AR，99%

DL-Homocysteine花生四烯酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.0% (GC)乙酰酮 CP，98%

Fmoc-Arg(Mtr)-OH腺苷-5'-磷酸 from yeast, ≥97%乙酰酮 HPLC

Fmoc-Arg(Pbf)-OH對(duì)氨基苯胂酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品乙酰酮 GR，99.5%

Fmoc-Glu(OtBu)-OH4-氨基聯(lián)苯 AR人參皂苷 Rb1  分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

Glycine tert butyl ester hydrochloride4-氨基聯(lián)苯 分析標(biāo)準(zhǔn)品人參皂甙 Rb2 分析標(biāo)準(zhǔn)品

Potassium L-glutamate艾 分析標(biāo)準(zhǔn)品（）人參皂甙 Rh2 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

2-Ami-1-phenylethal二乙基二硫代氨酸銨 高純級(jí)人參皂甙 Rg1 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

cis-4-Hydroxy-D-proline乙酰輔酶A三鋰鹽 95%人參皂甙 Rg2 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

DON4-氮雜苯并咪唑 99%人參皂甙 Rg3 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

匹格列酮鹽酸鹽（標(biāo)準(zhǔn)品）Fibronectin (FN)  纖維連結(jié)蛋白(多肽抗原)SP-D/PSPD  肺表面活性蛋白D抗體

苯噻啶蘋果酸鹽FGF-7/KGF (Keraticyte growth factor precursor)  成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-7/纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (抗原)SPC25  紡錘體極點(diǎn)構(gòu)成蛋白25抗體

硫酸多粘菌素BFGFR1 peptide  堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1（多肽抗原）SP-C  肺表面活性蛋白C抗體

硫酸多粘菌素B(標(biāo)準(zhǔn)品)FGFR2(Fibroblast Growth Factor Receptor 2)  成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2抗原SP-B  肺表面活性蛋白B抗體

醋酸普蘭林肽FGF-8/HBGF-8 (Fibroblast growth factor 8)  成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8/纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8 (抗原)SPATA12  特異表達(dá)新基因5抗體

普伐他丁鈉（標(biāo)準(zhǔn)品）GAD-65 (glutamate decarboxylase)  谷氨酸脫羧酶-65(C端多肽)SPARCL1/Ecm2  細(xì)胞外基質(zhì)蛋白2抗體

普伐他丁鈉GAPDH(Ribbt Anti-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogease )   3-磷酸甘油醛脫氫酶（抗原）SPARC  富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白抗體

潑尼松龍Galectin-3   半乳糖凝集素-3(抗原)SPANX  腫瘤/抗原11.3抗體

潑尼松龍（標(biāo)準(zhǔn)品）GCS (glucosylceramide synthase, GCS)  葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶（抗原）SPAG8  相關(guān)抗原8抗體

/孕酮GFP  綠色熒光蛋白SPAG5/MAP126/Astrin  相關(guān)抗原5抗體
諾卡菌通用PCR檢測(cè)試劑盒廠家人肺癌標(biāo)志物ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：10個(gè)

人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(SP-A)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1個(gè)

人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白B(SP-B)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(SP-C)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT250毫克

人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白D(SP-D)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100克

人肺部活化調(diào)節(jié)趨化因子(PARC/CCL18)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：2～8℃5克

人肺耐藥蛋白(LRP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100毫升

人肺炎衣原體抗體(Cpn-Ab)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT25克
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。